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Dettagli:
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| Nome di prodotti: | qPCR | Temperatura di stoccaggio: | – °C 20 |
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| Robusto e attivo per la sintesi del cDNA: | fino a 55°C. | Applicazione: | PCR |
| Volume: | 1ml | Trascrizione inversa: | gamma di temperature (42-60°C) |
| Evidenziare: | Multisala universale QPCR di TaqMan,Reagente biochimico della multisala QPCR di TaqMan,multisala QPCR di 1ml TaqMan |
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Miscela matrice di TaqMan del qPCR universale della multisala
Principi di progettazione dell'iniettore:
1. La lunghezza del prodotto di amplificazione è raccomandata per essere fra il punto di ebollizione 80-300;
2. Lunghezza dell'iniettore: 18-25 punto di ebollizione;
3. Il contenuto della base G+C su iniettori dovrebbe essere fra 40%-60%;
4. La differenza del valore del TM fra gli iniettori di andata e gli iniettori inversi è di meno che 2℃ ed il valore del TM fra 58-62℃ è il la cosa migliore;
5. Casualità di distribuzione bassa;
6. Gli iniettori non dovrebbero contenere le sequenze auto-complementari, altrimenti formeranno una struttura secondaria della forcella;
7. Ci dovrebbe essere non non più di 4 complementari o basi omologhe fra due iniettori, altrimenti il dimero dell'iniettore sarà formato, particolarmente sovrapposizione complementare al 3' estremità;
8. Il 3' base terminale dell'iniettore è suggerito per essere G o C;
9. Nessun altro prodotto non specifico è stato trovato nei risultati di confronto di NCBI.
Introduzione della miscela matrice di TaqMan del qPCR universale della multisala:
Questo prodotto è una soluzione della premiscela 2x per qPCR facendo uso del metodo chimerico della fluorescenza di verde I di GSK. La componente del centro, DNA polimerasi di Taq, è una DNA polimerasi calore-attivata bloccata con il metodo dell'anticorpo, che può efficacemente inibire l'amplificazione non specifica nelle condizioni termiche di bassa temperatura. Nel frattempo, combinato con l'amplificatore della reazione ha ottimizzato per qPCR, la DNA polimerasi di Taq è molto adatta ad alta reazione del qPCR della sensibilità e di specificità. Una buona curva standard può essere ottenuta in ampia area quantitativa, che è accurata, riproducibile ed affidabile per l'analisi quantitativa dei geni dell'obiettivo. Allo stesso tempo, questo prodotto contiene una tintura passiva di riferimento dello speciale ROX che è adatta ad uso in tutti gli strumenti del qPCR e non c'è necessità di regolare la concentrazione di ROX sugli strumenti differenti. La tintura blu si aggiunge nella premiscela, che ha l'effetto dell'elemento tracciante di aggiunta dei campioni ed il diluente giallo del modello è fornito allo stesso tempo. Quando il modello è diluito con il diluente giallo del modello ed ha aggiunto nella premiscela blu della reazione, i cambiamenti di colore dal blu a verde, che può svolgere un ruolo dell'elemento tracciante nella preparazione del processo del sistema di reazione ed impedire la perdita o il misaddition. Le gamme di tinture blu e gialle non si sovrappongono con le tinture del qPCR e non colpiscono i risultati della reazione.
Protocollo/procedure di analisi circa la miscela matrice di TaqMan del qPCR universale della multisala:
1. Diluizione (facoltativa) del modello:
Questo corredo fornisce un amplificatore GIALLO di diluizione del modello 40x, una diluizione gialla del modello diluita 40 volte che può essere usata per determinare esattamente se il modello si è aggiunto al liquido della reazione del qPCR cambiando il colore del liquido. Prendendo il sistema di reazione del qPCR 20ul come esempio, secondo l'importo del modello di diluizione ha aggiunto nella soluzione della reazione del qPCR 20ul, il metodo corrispondente di diluizione del modello originale può riferirsi alla seguente tavola (che prende il modello originale diluito a 100ul come esempio):
| Aggiunga il modello diluito alla soluzione della reazione del qPCR 20ul (UL) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Aggiunga l'amplificatore di diluizione del modello di GIALLO 40x al sistema di diluizione del modello 100ul (UL) | 50 | 25 | 16,7 | 12,5 | 10 | 8,4 | 7,2 | 6,3 |
| Aggiunga il sistema di diluizione del modello 100ul al modello primario (UL) | x | x | x | x | x | x | x | x |
| volume di aggiunta della nucleasi - acqua libera (UL) | 50-x | 75-x | 83.3-x | 87.5-x | 90-x | 91.6-x | 92.8-x | 93.7-x |
Esempio:
2ul ha diluito il modello dovrebbe aggiungersi al sistema di reazione del qPCR 20ul.
Prendendo il sistema di diluizione del modello 100ul come esempio, quando il volume originale del modello è 20ul, l'amplificatore giallo di diluizione del modello di 25ul 40x si aggiunge e poi l'acqua senza nucleasi 55ul si aggiunge al volume totale di 100ul.
L'AMPLIFICATORE GIALLO di DILUIZIONE del MODELLO 40x ora è 10x. Aggiunga 2ul del modello diluito in un amplificatore di diluizione di diluizione 20ul e l'amplificatore finale di diluizione del modello di GIALLO 40× è 1x. In conclusione, l'amplificatore giallo di diluizione del modello dovrebbe essere 1x nel sistema finale del qPCR.
Informazioni di prodotto della miscela matrice di TaqMan del qPCR universale della multisala:
| Nome di prodotto | Identificazione del prodotto | Modello |
| Miscela matrice di TaqMan del qPCR universale della multisala | GS-MBP0044-01 | 1ml |
| GS-MBP0044-05 | 5×1 ml | |
| GS-MBP0044-15 | 15×1 ml |
Termini di trattamento e di stoccaggio con la miscela matrice di TaqMan del qPCR universale della multisala:
Trasporto bagnato della borsa per il ghiaccio; Immagazzinato alla temperatura di -20℃, valida per 12 mesi.
Nota: Se il modello non deve essere diluito, o se il diluente del modello di G3362-2 non è usato, potete trascurare questo punto.
2. procedura di reazione di PCR (può essere il regolato secondo gli strumenti):
a: Se la specificità di amplificazione deve essere migliorata, la temperatura di tempera o di procedura in due tappe può essere usata; Per migliorare l'efficienza di amplificazione, una procedura in tre tappe o un tempo di estensione può essere usato.
Nota:
1. Indossi prego i guanti eliminabili durante il funzionamento per evitare la contaminazione della RNAsi.
2. I prodotti inversi della trascrizione possono essere immagazzinati a -20℃ per un breve periodo. Se il deposito a lungo termine è necessario, è raccomandato per immagazzinarli a -80℃ dopo l'imballaggio per evitare i cicli di gelo-disgelo ripetuti.
3. Se il modello è dell'origine eucariotica, è raccomandato per selezionare (distacco) l'iniettore oligo 18 e lo accoppia con il 3' poli una coda del mRNA eucariotico per ottenere il più alto rendimento di cDNA integrale.
4. Per trascrizione inversa di RNA prokaryotic, l'iniettore o Gene Specific Primer casuale di esamero dovrebbe essere usato.
5. L'iniettore casuale di esamero ha ampia applicabilità ed è adatto a mRNA, a rRNA, a tRNA, a piccolo RNA ed a modelli del lncRNA.
6. Se la trascrizione inversa è seguita dall'analisi del qPCR, (distacco) l'iniettore oligo 18 e l'iniettore casuale di esamero possono essere mescolati per rendere ad efficienza della sintesi del cDNA in tutte le regioni di mRNA lo stesso, che contribuisca a migliorare l'autenticità e la ripetibilità dei risultati quantitativi.
7. Se gli iniettori successivi del qPCR sono progettati attraverso gli esoni, il punto di rimozione del genoma può essere omesso.
Problemi comuni e soluzioni:
| Descrizione del problema | Ragioni possibili | Soluzioni |
| Alla conclusione della reazione, nessuna curva di amplificazione è comparso o il valore di CT è comparso troppo tardi | La concentrazione nel modello è troppo bassa | Ripeti l'esperimento per ridurre il multiplo di diluizione del modello e l'inizio dall'più alta concentrazione quando la concentrazione del campione è sconosciuta |
| Degradazione del modello | Il modello è stato preparato ancora e l'esperimento è stato ripetuto | |
| Ci sono inibitori di PCR nel sistema | Generalmente, il modello è portato dentro, il rapporto di diluizione del modello è aumentato o il modello con elevata purezza reprepared e ripetuto | |
| Gli iniettori possono degradarsi | Gli iniettori che non sono stati utilizzati a lungo dovrebbero in primo luogo essere collaudati ad integrità tramite l'elettroforesi della PAGINA per eliminare la possibilità di degradazione | |
| Efficienza bassa di amplificazione | il ncrease la concentrazione nell'iniettore, prova una procedura in tre tappe di amplificazione, o riprogetta l'iniettore | |
| Il prodotto di amplificazione è troppo lungo | La lunghezza del prodotto di amplificazione è stata controllata nell'ordine del punto di ebollizione 80-300 | |
| Il controllo in bianco mostra il segnale | Inquinamento del sistema di reazione | In primo luogo, l'acqua di controllo in bianco dovrebbe essere sostituita. Se la stessa situazione ancora accade, gli iniettori, gli aspiratori ed i tubi di PCR dovrebbero essere sostituiti o una nuova miscela matrice dovrebbe essere iniziata. Il sistema di reazione è preparato in una tavola pulita eccellente per ridurre l'inquinamento dell'aerosol |
| L'amplificazione non specifica quali i dimeri dell'iniettore compare |
Generalmente, per i prodotti di amplificazione è normale comparire nel controllo in bianco dopo 35 cicli, che dovrebbero essere analizzati con la curva di fusione. L'iniettore della riprogettazione, regola la concentrazione nell'iniettore o ottimizzare la procedura della reazione di PCR |
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| La curva di fusione ha picchi multipli | La progettazione dell'iniettore è povera | Il nuovo iniettore è stato riprogettato secondo i principi di progettazione dell'iniettore |
| La concentrazione nell'iniettore è troppo alta | Riduca giustamente la concentrazione nell'iniettore | |
| C'è contaminazione genomica in modello del cDNA | La soluzione estratta del RNA si digerisce facendo uso degli enzimi del DNA, quale DSDNase, per rimuovere la contaminazione genomica, o per progettare gli iniettori del transintron | |
| Riproducibilità difficile degli esperimenti | L'errore di aggiunta del campione è grande |
L'uso della pipetta accurata, con la pipetta accurata della testa di aspirazione di alta qualità; Alto modello di diluizione, aggiungente il grande modello del volume per ridurre errore di campionamento; Il volume della reazione di qPCR è stato ingrandetto |
| La concentrazione nel modello è troppo bassa | Ripeti l'esperimento per ridurre i tempi di diluizione del modello | |
| Deviazione di temperatura alle posizioni differenti dello strumento del qPCR | Calibri regolarmente lo strumento del qPCR | |
| La curva di amplificazione non è liscia | Il segnale della fluorescenza è troppo debole, prodotto dopo la correzione del sistema |
Assicuri che le tinture premescolate nella miscela matrice non siano degradate; Sostituisca il segnale fluorescente raccogliere meglio i materiali di consumo del qPCR |
| Rotture o slittamenti della curva di amplificazione | La concentrazione nel modello era più alta ed il valore di punto finale della linea di base era maggior del valore di CT | Il punto finale della linea di base (valore -3 di Ct) è stato ridotto ed i dati è stato analizzato nuovamente |
| Le curve di amplificazione di singoli pozzi sono caduto improvvisamente acutamente | Ci sono bolle nel tubo della reazione |
Assicuri che la MISCELA completamente sia dissolta e non turbini e non oscilli neppure; Dopo che il campione si aggiunge, le bolle sono rimosse tramite centrifugazione con elastico leggero. Il momento di pre-denaturazione è stato estendere al min 10 di rimuovere le bolle |
Se avete bisogno di più informazioni sulla miscela matrice di TaqMan del qPCR universale della multisala, prego sappiamo online, grazie.
Persona di contatto: Ms. Kris Zhang
Telefono: 0086-0769-85914911
